ВВЕДЕНИЕ

Молекулярная клиническая диагностика — наука, выявляющая причины и механизмы инфекционных и соматических заболеваний на молекулярном уровне, который включает в себя определение генов и продуктов их деятельности – протеинов и нуклеиновых кислот.
Как отдельное направление она начала бурно развиваться в начале 70-х годов после фундаментальных открытий в области молекулярной биологии: во-первых, создание моноклональных антител, взаимодействующих только с определёнными эпитопами (антигенными детерминантами); во-вторых, изобретение метода гибридизации на фильтрах (Саузерн-блотт), названного так по фамилии учёного, предложившего данный способ разделения нуклеиновых кислот (НК). И, наконец, ещё одним «критическим» научным событием стало открытие в 1985 году метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Эти достижения коренным образом изменили содержание всей молекулярной клинической диагностики.

В современной лабораторной диагностике ПЦР занимает особое место. Метод ПЦР поднял клиническую лабораторную диагностику на принципиально иную высоту — уровень определения нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), что позволяет провести прямое обнаружение инфекционного агента или генетической мутации в любой биотической или абиотической среде. При этом способом ПЦР, теоретически, может быть обнаружена всего одна искомая молекула НК среди миллионов других молекул НК. В связи с этим возникает один немаловажный вопрос, принципиальный для инфектологии, насколько тождественны понятия — «НК” и «возбудитель”. С точки зрения общей микробиологии это неравнозначные понятия, т.к. возбудитель это сложная биологическая система, включающая в себя НК, цитоплазму, оболочку и продукты жизнедеятельности микроорганизма. Но при этом НК не может обойтись вне этой сложной структуры, как и сам патоген не может существовать без НК. Поэтому с позиции клинической медицины определение НК является эквивалентом обнаружения/не обнаружения возбудителя в объекте исследования.

Разнообразны области применения метода ПЦР: общая и частная биология, ветеринария, фармация, экология — как способ контроля за качеством объектов окружающей среды и продуктов питания, криминалистика (идентификация личности и отцовства). Особенно эффективным оказалось применение метода в клинической медицине.

Цель данного методического пособия ознакомить широкий круг практикующих врачей различных специальностей (клиницистов, лаборантов, судебных и санитарных медиков и т.п.) с принципами и практическими возможностями метода ПЦР для диагностики различных инфекционных, генетических и онкологических заболеваний.

ПРИНЦИП МЕТОДА ПЦР

В основе метода ПЦР лежит уникальное свойство НК (как ДНК, так и РНК) — способность к саморепродукции, которая воспроизводится искусственно in vitro. При этом синтезируются только строго специфические фрагменты НК. В связи с этим, прежде чем проводить ПЦР, необходимо узнать нуклеотидную последовательность искомой НК. После этого синтезируются два коротких ДНК-зонда или праймера, которые комплементарны соответствующим участками НК-мишени. Праймер – самый главный элемент в ПЦР, обеспечивающий запуск и специфичность реакции. Таким образом, тест-система для ПЦР состоит из смеси НК испытуемого образца, праймера, дезоксирубонуклеотидов (набора нуклеотидтрифосфатов) и термостабильной ДНК полимеразы (энзима термофильных бактерий Termus aquaticus). Вышеуказанную реакционную смесь подвергают повторным циклам нагревания/охлаждения для денатурации (при нагревании) НК и гибридизации или отжиге (при охлаждении) праймеров с целью синтеза (с помощью ДНК-полимеразы) новых НК.

Ход ПЦР схематично показан на рис. 1, где представлены три основных этапа собственно амплификации: денатурации, отжига и синтеза (удлинения) НК. Сама полимеразная реакция проходит автоматически в программируемом термостате – термоциклере (амплификаторе), который может нагревать и охлаждать пробирки с реакционной смесью в очень короткое время. Трехступенчатый цикл, в результате которого получаются точные копии идентифицируемого участка матричной НК, повторяется 30-50 раз в соответствии с заданной программой термоциклера.
В первом цикле происходит первое удвоение фрагмента нити НК, ограниченного праймерами, в последующем реакция приобретает каскадный характер (цепная реакция). Это означает, что каждая из нитей служит матрицей для синтеза (полимеризации) нового участка НК, что позволяет увеличивать число копий амплифицируемого фрагмента НК в геометрической прогрессии

Применение ПЦР

Области применения полимеразной цепной реакции как современного метода молекулярной биологии разнообразны. Во многом это обусловлено широтой материала, который можно анализировать (практически все, из чего можно выделить более-менее качественую ДНК может стать объектом исследования), а также подобранных праймеров. Основные области применения ПЦР:

клиническая медицина

  • диагностика инфекционных заболеваний
  • диагностика наследственных заболеваний
  • выявление мутаций
  • генотипирование
  • клеточные технологии
  • создание генетических паспортов

экология

  • мониторинг состояния окружающей среды
  • анализ продуктов питания
  • анализ генетически-модифицированных организмов (ГМО)

судебная медицина и криминалистика

  • идентификация личности
  • установление отцовства

фармакология

ветеринария

научные исследования (молекулярная биология, генетика)

Организация лаборатории ПЦР

  • Общая информация по организации ПЦР-лабораторий
  • Требования к организации помещений для лаборатории ПЦР
  • Главная проблема лабораторий ПЦР
  • Классическая ПЦР-лаборатория
  • ПЦР в модификации FLASH
  • Расходные материалы в ПЦР-лаборатории
  • Нормативно-правовые документы по ПЦР

Информация для заказа

Наименование Объем Производство Метод Кат.Номер
PrecisionShuttle pTUNE Индуцируемый Вектор OriGene PS100021
Вода без нуклеаз R0582
Наконечники Vertex на 10 мкл, с фильтром, бесцветные, градуированные, стерильные, 96 шт/штатив SSI SSI-4117NSFS
Наконечники Vertex на 10 мкл, с фильтром, удлиненные, бесцветные, градуированные, стерильные, 96 шт/штатив SSI SSI-4137NSFS
Ноутбук с предустановленным специализированным программным обеспечением (для ДТ-96, ДТ-322, Джин-4, Джин) ДНК-Технология ПЦР в реальном времени I-PC/01
Устройство для запечатывания микропланшет»ДТпак» ДНК-Технология ПЦР в реальном времени O-DTPACK

ПЦР ( Полимеразная цепная реакция ) Если попытаться описать ПЦР-диагностику в трёх словах, то это, совершенно определённо, будут слова ТОЧНО, НАДЁЖНО, БЫСТРО. На сегодняшний день, ПЦР-диагностика является самым точным и чувствительным методом выявления инфекционных и генетических заболеваний. За 30 лет, с момента своего появления в 1983 году, этот уникальный метод уверенно завоевал весь мир, принеся своему изобретателю Кэрри Мюллису, Нобелевскую премию в области химии за 1993 год. Изящность, простота исполнения, непревзойденные показатели чувствительности и специфичности принесли новому методу небывалую, но абсолютно заслуженную популярность.

Диагностика инфекционных заболеваний, в том числе вызванных трудно культивируемыми микроорганизмами, их генотипирование, оценка вирулентности (степень болезнетворности), определение устойчивости микрофлоры к антибиотикам, пренатальная диагностика генетических заболеваний, биоконтроль препаратов крови — вот неполный перечень направлений, где с успехом применяется ПЦР.

Достоинства ПЦР-диагностики:

  • Высочайшая специфичность – В процессе анализа в исследуемом материале выделяется фрагмент ДНК, специфичный (присущий) только конкретному возбудителю — бактерии или вирусу. Этот участок ДНК уникален и не характерен ни для одной другой инфекции на Земле. Можно говорить, что специфичность метода достигает 100% или близка к этому. Это позволяет в одном и том же материале, проводить одновременный поиск нескольких возбудителей без какого-либо ущерба качеству.
  • Высочайшая чувствительность – Метод ПЦР позволяет выявить одну-единственную болезнетворную бактерию среди миллиардов других, предоставив через несколько часов, 50 миллиардов ее копий! Он работает там, где другие методы: микроскопический, бактериологический, иммуноферментный, бессильны. Достоверный диагноз при помощи ПЦР можно ставить по 10 — 100 возбудителям в пробе, в то время как для других тестов эта цифра составляет 1000 — 1000 000.
  • Оперативность — Постановка реакции занимает всего несколько часов, т.к. не требуется искусственное выращивание возбудителя. Процесс максимально автоматизирован. Таким образом, вся диагностика, от момента сдачи материала на анализ до получения результата, отнимет один день.
  • Прямое определение возбудителей инфекционных заболеваний – методом ПЦР определяют возбудителя, а не реакцию на его внедрение со стороны организма. Таким образом, появилась возможность точно диагностировать заболевание еще в инкубационном периоде, когда нет никаких клинических или лабораторных признаков болезни.
  • Абсолютная универсальность — ПЦР позволяет обнаруживать любые ДНК и РНК, даже когда бессильны другие методы. Оборудование, используемое для ПЦР, стандартно, оно не зависит от того, что именно и где именно мы ищем. Для ПЦР-исследования может применяться практически любые материалы, в том числе недоступные для исследования другими методами: слизь, моча, кровь, сыворотка, мокрота, эякулят, соскоб эпителиальных клеток, почва и т.д.

Описание метода

Думается, пришло время, перейти от восторженных эпитетов и хвалебных речей к описанию, собственно ПЦР метода. И постараться сделать это так, чтобы даже максимально далёкий от молекулярной биологии читатель, смог оценить красоту и изящество метода, а заодно уяснить за что же, собственно, дают Нобелевскую премию….

Для начала, нужно понять сущность решаемой задачи и основную проблему, мешающую нам всё устроить легко и просто….

Уже задолго до начала 80-х годов учёным биологам было ясно, что анализ генетической информации содержащеёся в хромосомах любой живой (да и не вполне живой, тоже) клетки, позволяет однозначно определить хозяина этих клеток. Это относится, как к человеку и животным, так и к мельчайшим бактериям и вирусам – без исключений. Вся генетическая информация записана внутри ДНК. Так вот, решаемая в ту пору задача формулировалась весьма просто — хорошо бы найти метод, который позволил бы извлекать из клетки ДНК, и идентифицировать ее по принципу: «Это ДНК вируса гриппа, это — стафилококка, а это — хламидии». Тогда, взяв у человека каплю крови, мокроту, мочу и т.д., можно было бы легко установить, не содержатся ли в этих биологических пробах возбудители инфекций. Но… Во-первых, выделить ДНК из клеток неповрежденной практически невозможно — она рвется в произвольных местах, и даже выделяя её 100 раз из 100 одинаковых клеток, мы получим тысячи кусков генов во фрагментах разной длины. Ясно, что ни сравнивать, ни анализировать тут будет нечего. Во-вторых, даже если каким-то чудом удастся выделить и безошибочно определять ДНК возбудителя инфекции, сложности остаются. Ведь ДНК, например, вируса, содержится в пробе, среди миллиардов других клеток, в таких ничтожных количествах, что её запросто можно не заметить, и получить отрицательный результат вместо положительного. Можно, конечно, искусственно вырастить культуру для увеличения объема вирусной ДНК, но, во-первых, не все возбудители болезней хорошо культивируются в искусственных условиях, и, во-вторых, на это требуется значительное время…

Теперь нам пора разобраться с мироустройством, и начать называть вещи своими именами. Итак, что же это такое ДНК и РНК, как это всё устроено и из чего состоит ?

Каждая клетка любого живого существа (животного, растения, человека, бактерии, вируса) имеет хромосомы. Хромосомы – это хранители генетической информации, которые содержат всю последовательность генов каждого конкретного живого существа, его геном. Каждая хромосома состоит из двух нитей ДНК, закрученных в спираль друг относительно друга. Это весьма напоминает винтовую лестницу, «перила» которой удерживаются вместе за счёт «ступенек».

ДНК (ДезоксирибоНуклеиновая Кислота) имея чрезвычайно сложную структуру, тем не менее, строится из достаточно простых структурных компонентов, тех самых «ступенек» – нуклеотидов.

Нуклеотиды бывают 5-и видов :

  • Тимин (Thymine) ( T )
  • Аденин (Adenine) ( A )
  • Гуанин (Guaninne) ( G )
  • Цитозин (Citosine) ( C )
  • Урацил (Uracil) ( U )

Нуклеотиды располагаются друг за другом в строгой индивидуальной последовательности, образуя гены. Один ген может состоять из 20-200 таких нуклеотидов. Например, наш ген, определяющий выработку инсулина, состоит из 60 пар нуклеотидов.

«Ступеньки» в нашей «лестнице», на самом деле не целые, а состоят из 2-х половинок – 2-х разных нуклеотидов. Но всё дело в том, что половинки не могут соединяться, как попало, а только особыми «комплементарными» парами. Комплементарность – это точное взаимное соответствие и взаимное дополнение. Если хотите — единство противоположностей! Нуклеотиды обладают свойством комплементарности, т.е. сцепляться друг с другом могут только нуклеотиды, входящие в одну комплементарную пару. Никакие другие связи в природе не возможны. Это весьма напоминает поведение магнитов, когда южный полюс легко сцепляется с северным, а попытки соединить юг с югом и север с севером обречены на провал… Здесь тоже самое, только полюсов не два, а четыре (попробуйте это себе представить). Свойство комплементарности — ключевое в методе ПЦР.

Комплементарными являются пары Тимин — Аденин и Гуанин – Цитозин.

Практически это означает, что напротив аденина (A) в одной цепочке ДНК, в другой цепочке обязательно стоит тимин (T), а напротив гуанина (G) – цитозин (C). Схематически всё это выглядит следующим образом:

Кроме ДНК, точно такую же структуру имеет РНК ( рибонуклеиновая кислота ), отличающаяся от ДНК тем, что вместо тимина в ней используется урацил и комплементарная пара имеет вид A — U.

РНК – является хранителем генетической информации у некоторых вирусов, которые называются ретровирусами. Наиболее известный и активно изучаемый представитель этого поганого семейства — ВИЧ.

Чтобы представить сложность структуры ДНК и РНК, вдумайтесь в следующий факт: если развернуть спираль ДНК, её длина окажется около ста восьмидесяти сантиметров. Не смотря на то, что размеры клетки исчисляются микронами, из-за очень специфической плотной упаковки спирали, ядро клетки свободно вмещает десятки хромосом.

Итак, пора переходить к решению задачи.

Рассматривая поставленную выше задачу, мы уже увидели две основных проблемы на пути к её решению. Понятно, что с одной стороны, выискивать клетку возбудителя инфекции среди миллионов клеток крови – занятие достаточно бесперспективное, если не сказать бестолковое, а с другой стороны, выделять ДНК из клеток » в рукопашную» – тоже не вариант, из-за опасности порвать на кусочки, всё что мы с таким трудом отыскали… Поэтому, нам очень помог бы какой-нибудь метод, позволяющий активно размножать ДНК, но делающий это только с определёнными, «избранными» экземплярами. Это позволит увеличивать концентрацию интересующей культуры до уровней, безошибочно определяемых и не требующих длительного поиска.

Вот этим чудо-методом и стал метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). В основе метода ПЦР лежит природный процесс — комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы. Эта реакция носит название репликации ДНК. Так это звучит сухим академическим языком. Но мы задались целью, объяснить Вам всё, буквально, «на пальцах», а потому продолжим свой рассказ о том, как всё происходит.

На первом этапе реакции надо разъединить двойную нить ДНК. Этот процесс называется денатурацией и проходит при температуре 93 — 95 градусов Цельсия. Уже через 30 — 40 секунд связи нуклеотидов разрываются и вместо двойной цепи получаются две одиночные.

Надо заметить, что если после этого, снова, просто понизить температуру, то разделившиеся половинки достаточно быстро находят друг друга и всё возвращается, практически, к исходному состоянию. Следовательно, нам надо не дать соединиться половинкам интересующей нас ДНК. Как этому помешать? – приставить на её место (хотя бы временно) что-то, что точно соответствует небольшому фрагменту ДНК и в точности повторяет комплементарную последовательность небольшой цепочки нуклеотидов. Тогда, место на половинке-основании окажется занято, при попытке присоединения, свойство комплементарности окажется нарушено, и вторая половинка не сможет прицепиться на своё «законное» место. Это «что-то» названное праймером, синтезируется в научной или промышленной лаборатории и представляет собой цепочку синтетических нуклеотидов (олигонуклеотидов), расположенных в таком же порядке, как и у того вируса (бактерии и так далее), на который делается анализ. Например, если делают анализ на хламидии, то праймер соответствует специфическому участку гена, кодирующего главный белок наружной мембраны (МОМР) Chlamydia trachomatis.

Итак, вторая стадия — присоединение праймеров к ДНК (также называется отжигом) длится от 20 до 60 секунд. Температура отжига равна 50 — 65 градусам (для каждого вида возбудителей, т.е. для каждого праймера, она своя).

На этом этапе мы уже разделили ДНК на две половинки и не даём им соединиться. Теперь самое время достроить каждую половинку до полноценной ДНК. Но температура, при которой это должно произойти, очень высока, по меркам молекулярной биологии – более 70 градусов (выше температуры отжига). Проблема была решена благодаря открытию уникального фермента taq-ДНК-полимеразы, содержащегося у бактерий, обитающих в гейзерах. Особенность этого фермента заключается в его исключительной термостойкости (период полужизни при 95 градусах составляет 40 минут) и высокой рабочей температуре — оптимум работы 72градуса. В клетках, фермент ДНК-полимеразы отвечает за копирование и «ремонт» ДНК и способен удлинять короткие нуклеотидные цепочки праймеров, последовательно присоединяя к одному из концов праймера дополнительные нуклеотиды, таким образом, достраивая цепь до конца. Так ДНК копирует саму себя.

Третий этап — достраивание цепей ДНК. Комплементарное достраивание цепей ДНК происходит от конца к концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор «кирпичики» — все те же производные аденина, гуанина, цитозина и тимина. Процесс синтеза катализируется ферментом термостабильной ДНК-полимеразой (Taq-полимеразой) и проходит при температуре 70 — 72 градуса. Время протекания синтеза зависит от длины достраиваемого фрагмента и обычно принимается равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований.

Теперь мы имеем две двойные цепочки ДНК вместо одной, исходной.

Ну а дальше процесс повторяется. Опять температура повышается до 93 — 95 градусов, цепочки разъединяются… и так далее. Обычно за 1 — 2 часа при наличии вирусной ДНК ее становится столько, что не заметить ее, даже при стандартном методе обнаружения становится просто нереально.

Схематично, это выглядит так:

Подведём итог: каждый цикл ПЦР состоит из трех стадий. В первую стадию (денатурация) происходит так называемое раскручивание ДНК – то есть разделение связанных между собой двух цепей ДНК. Во вторую (отжиг) — происходит присоединение праймера к участку нити ДНК. И, наконец, в заключительной третьей стадии, «фермент-строитель» достраивает нити, восстанавливая ДНК. В настоящее время весь этот сложный процесс протекает в одной пробирке и состоит из повторяющихся циклов размножения (амплификаций) определяемой ДНК с целью получения большого количества копий, которые могут быть, затем выявлены обычными методами. То есть из одной нити ДНК мы получаем сотни тысяч или миллионы копий.

Детекция и Real-Time PCR

Полимеразная цепная реакция требует быстрой смены температур, ведь идет она в три этапа. Поначалу для каждой стадии использовали отдельную водяную баню, что сильно увеличивало время получения результата. Поставить «на поток» метод помогли специальные автоматические термостаты — амплификаторы, в которых изменение температуры происходит по заданной программе. Современный амплификатор – сложный электронный прибор, не только управляющий циклами амплификации и поддерживающий необходимые температуры, но и делающий количественные замеры после каждого цикла.

Эта технология называется «Real-Time PCR», или ПЦР в реальном времени. В её основе лежит принцип флуоресцентной детекции продуктов ПЦР непосредственно в ходе амплификации. Детекция продуктов амплификации проводится прямо в реакционной среде через стенки или крышку закрытой пробирки.

Для этого в состав реакционной смеси, наряду с праймерами и другими компонентами реакции, добавлены специальные флуоресцентные метки (зонды). Флуоресцентный зонд выполнен по той же технологии, что и праймер и отличается он него тем, что на одном его конце прикреплена флуоресцентная молекула (флуорофор), а на другом конце расположена специальная молекула-гаситель флуоресценции. За счёт близости гасителя, энергия поглощаемая флуорофором не вызывает флуоресцентного свечения, а целиком передаётся гасителю. При этом, при облучении смеси ультрафиолетом, флуоресцентный отклик полностью отсутствует.

Дальше всё происходит, так же, как было описано выше:

  • В ходе ПЦР при повышении температуры происходит денатурация ДНК с распадом на две половинки.
  • Зонд вместе с праймерами присоединяется к комплементарному участку ДНК.
  • В процессе восстановления и синтеза новой цепи ДНК, фермент ДНК-полимеразы расщепляет этот зонд и разрушает его. При этом флуорофор и гаситель освобождаются, расстояние между ними увеличивается и эффект гашения перестаёт работать. Теперь при облучении смеси ультрафиолетом, мы получим устойчивый флуоресцентный сигнал-отклик от флуорофора.

Изготавливая молекулы флуорофора с разным цветом свечения можно проводить одновременный поиск разных возбудителей в одной пробирке.

Большинство используемых сегодня, для ПЦР диагностики, амплификаторов , относится к классу автоматических, высокоскоростных многофункциональных Real Time аппаратов. Они позволяют проводить множественный ПЦР анализ до 5 мишеней (цветных флуоресцентных красителей) в 96 пробирках одновременно. Это полностью автоматические термоциклеры со встроенным оптическим блоком и возможностью детекции накопления продуктов амплификации непосредственно в пробирке во время протекания реакции. Весь процесс амплификации протекает в закрытых одноразовых пробирках, считывание происходит через прозрачные стенки пробирок, без их открытия. Например, на фото CFX96 Touch, производства американской компании Bio-Rad

Особенности и недостатки метода

Безусловно, ПЦР не идеальный метод, и у него имеются свои недостатки. Но они напрямую связаны с его достоинствами и с тем, что называется «человеческим фактором».

  • ПЦР – высокотехнологичный метод, требующий соблюдения строжайших правил устройства и оснащения лаборатории. Достаточно сказать, что на рабочем месте, где происходит приготовление и раскапывание смесей по пробиркам, должен быть установлен фильтр биологической очистки со степенью более 99%. Это связано с тем, что в воздухе постоянно присутствует невероятный коктейль из фрагментов ДНК всевозможных живых организмов. И если в процессе подготовки к проведению реакции, образец будет загрязнен — возможно «ложное срабатывание».
  • С другой стороны, далеко не всегда положительный результат ПЦР означает наличие заболевания. Например, человек пролечился от какого-либо заболевания, но погибший и уже не опасный возбудитель (фактически его останки) будет еще некоторое время находиться среди клеток крови и «разбираться на запчасти» защитной системой организма. Если в этот момент сделать ПЦР – результат окажется положительным.
  • Другой вариант – это отрицательный результат ПЦР при наличии даже явной клинической картины. Одна из наиболее возможных причин – материал для исследования был взят «не оттуда». Образец должен брать квалифицированный врач, строго следуя инструкции, которую ему дает лаборатория.
  • При создании праймеров используют специфичный для данного микроорганизма фрагмент ДНК, наименее подверженный изменениям. Он выбирается из так называемой высоко консервативной области ДНК. Но изменчивость микроорганизмов может приводить к тому, что некоторые генотипы или штаммы исследуемого возбудителя могут приобретать и накапливать мутации в амплифицируемом (клонируемом) участке генома, и становиться неуловимыми для данного праймера, и тест-системы, в целом. Таким образом, различные тест-системы — одна из причин, почему анализы, сделанные в разных лабораториях и в разных клиниках «одним и тем же» методом ПЦР могут показывать разные результаты. Чтобы максимально избежать ошибок по вине мутаций, современные стандарты качества, регламентируют объем испытаний тест-системы, прежде чем она попадет на рынок и будет использована для диагностики. Эти испытания включают проверку на перекрестные реакции, а также тестирование всех известных штаммов определяемого возбудителя.

Полный список исследований методом ПЦР и цену на них можно посмотреть в разделе «Прейскурант»

Кому мы обязаны появлением метода ПЦР?

Со слов американского биохимика Керри Мюллиса (Kary Mullis), идея идентифицировать живые организмы по короткому участку их генетического кода (ДНК) пришла ему в голову в 1983 году, по пути с работы домой. А в основе этой идеи, лежала работа другого американского биохимика, Артура Корнберга (Arthur Kornberg), которая в свое время не нашла отклика у научного сообщества.

Керри допустил возможность того, чтобы взять молекулу ДНК какого-либо организма, с помощью высокой температуры «распустить» ее спираль на две нити, специфическими маркерами-праймеры пометить уникальные для этого микроорганизма участки ДНК и затем, применив фермент ДНК-полимеразу, создать из двух нитей две новые молекулы ДНК. Но уже содержащие в себе меченные праймеры. И потом останется просто искать эти участки в диагностическом материале.

В итоге, корпорация CETUS, в которой работал Мюлис, выделила ему команду ученых. И в 1985 году, в издании Американского общества генетики человека, появилась публикация с теоретическим обоснованием ПЦР, как метода идентификации генетического материала живых организмов.

Как это все происходит в лаборатории

Выделение ДНК

Сначала пробу биологического материала подготавливают: центрифугируют, осаждают и т.д. Затем лаборантам необходимо выделить ДНК из полученного биологического концентрата.
Амплификация (увеличение числа копий ДНК)
Важнейший этап исследования. Проводится в термоциклере и именно здесь проходят все процессы, подпадающие под определение полимеразно-цепная реакция: денатурация, отжиг, элонгация.
Денатурация
Самый первый этап – развернуть (денатурировать) нуклеиновые кислоты, чтоб сделать их доступными для дальнейшей работы. Осуществляется путем нагрева реакционной смеси до 80-90 °C.
Отжиг
Денатурированные (распущенные) ДНК/РНК обрабатывают праймерами — изготовленными в лабораторных условиях коротенькими цепочками нуклеиновых кислот. Благодаря запрограммированному участку, праймеры прикрепляются только к тем нуклеиновым кислотам, для которых были созданы. Например, праймер для вируса простого герпеса 1 типа, никогда не свяжется с ДНК другого вируса, микроорганизма или клетки.
Именно праймеры обусловливают крайне высокую специфичность ПЦР – способность реагировать только на нуклеиновые молекулы конкретных типов, видов классов и даже штаммов микроорганизмов. Или отдельные виды клеток живых организмов.

Элонгация

Или синтез. После завершения процесса отжига, в реакционной смеси создают условия для активности полимеразы. Фермент, ориентируясь на молекулы праймеров (а не исходных нуклеиновых кислот), начинает синтез новых ниток ДНК/РНК. Которые становятся копиями исходных, искомых молекул нуклеиновых кислот.
Такой температурный цикл проводится 30 и более раз. В результате, даже при изначально небольшом количестве искомого генетического материала, в реакционной смеси накапливается значительное число «помеченных» праймерами нуклеиновых кислот (растет экспоненциально, с удвоением при каждом цикле).Обнаружить большие количества ДНК/РНК намного проще, за счет чего реализуется еще одно преимущество ПЦР – высочайшая чувствительность.

Детекция

Оценка результатов ПЦР проводится несколькими путями:

  1. Электрофорез в вязкой среде. Суть в том, что ДНК/РНК заряжены электрически и движутся к одному из электродов. В среду (агар или полиакридный гель) добавляют краситель ДНК (например – бромистый этидий). В процессе сеанса электрофореза, молекулы нуклеиновых кислот движутся и формируют скопления, подкрашенные этидием. Под ультрафиолетом, это выглядит в виде полосок разной толщины и яркости.
  2. Метод гибридизации. Используются праймеры, заранее помеченные люминофором (флуорофором). После нужного числа температурных циклов, применяют специальный прибор – детектор флюоресценции. За счет того, что в образец можно добавлять флуорофоры для разных мишеней (они будут и светиться под ультрафиолетом разным цветом), метод гибридизации подходит для диагностики сразу нескольких мишеней в одном образце.
  3. ПЦР диагностика в реальном времени (real-time PCR). Отличается тем, что детекция проводится прямо в процессе амплификации. Для этого нужны зонды-люминофоры (из предыдущего пункта) и специальные приборы ДНК-амплификаторы. Эти устройства оценивают нарастание яркости люминофора после каждого температурного цикла и впоследствии, вычисляют исходное число искомых нуклеиновых кислот в образце.

Электрофорез и гибридизация подходят только для качественной оценки, то есть дают ответ на вопрос, есть ли в образце искомый материал. ПЦР в реальном времени – единственный доступный метод количественной оценки.
Если мишеней для праймеров в образце не окажется, то температурные циклы пройдут в холостую и при детекции будет получен отрицательный результат.

Преимущества методики ПЦР

Всего разработано более 10 разных методик амплификации, применяемых лабораториями в зависимости от исходных условий и поставленных целей.
Общим для них есть высокая чувствительность (для положительного результата достаточно 40 (!) или менее искомых копий ДНК в 1 мл образца, то есть вероятность ложноотрицательного ответа ничтожно мала. И очень высокая специфичность: вероятность ложноположительного ответа составляет менее 1%.
Но точность результатов сильно зависит от качества сбора диагностического материала, тщательного соблюдения всех технических требований к каждому этапу и качеству оборудования, расходных материалов (буфера, праймеров, раствора для отмывки и т.д.).

Области применения в медицине

В дерматовенерологии ПЦР используют для выявления венерических заболеваний: микоплазменной, хламидийной инфекций, сифилиса, генитального герпеса и др.
Инфекционисты активно используют ПЦР для диагностики туберкулеза, ВИЧ, вирусных гепатитов, герпеса, мононуклеоза, вируса Эпштейн-Барр и др.). А с помощью ПЦР в реальном времени, оценивая вирусную нагрузку, врачи могут составить мнение о динамике заболевания, отклике на лечение, что особенно актуально для пациентов с ВИЧ, принимающих терапию.
Также благодаря ПЦР врачи могут в течение нескольких дней с уверенностью идентифицировать коклюш и паракоклюш, выявить возбудителей эпидемии ОРВИ. Уточняются типы вируса гриппа, циркулирующие на определенной территории, на основании чего появляется возможность разработать эффективную вакцину для каждого сезона гриппа.
В течение суток или быстрее можно установить вид возбудителя кишечной инфекции, а значит – назначить адекватное лечение и обнаружить вероятный источник заражения.
Летом, ПЦР актуальна для диагностики заболеваний, передаваемых иксодовыми клещами: боррелиоза (болезни Лайма), клещевых энцефалитов.
Метод позволяет работать с любым биологическим материалом. Гемотрансмиссивные инфекции (сифилис, ВИЧ, гепатиты, боррелиоз) исследуются по пробе венозной крови или спинномозговой жидкости. Кожные болезни (герпес, грибки) – по соскобу с пораженного участка. Венерические и урологические – по образцу мочи, спермы, влагалищного отделяемого.
Так что в медицине, ПЦР применяется везде, где нужна высокая точность и быстрота получения результатов.

Лабораторные исследования, выполняющиеся методом ПЦР:

пцр диагностика на Инфекции:

ПЦР (полимеразная цепная реакция) — высокоточный метод лабораторной диагностики, позволяющий определять малые концентрации возбудителей инфекционных заболеваний в организме человека. Главным направлением развития рынка ДНК-диагностики является диагностика инфекционных заболеваний. В отличие от иммуноферментного анализа (ИФА), который широко используется в этой области, ДНК- диагностика позволяет определять непосредственно возбудителя заболевания. Технология ПЦР анализа широко применяется в диагностике урогенитальных инфекций, заболеваний, передающихся половым путем, гепатитов, ВПЧ, вирусных инфекций со значительной антигенной изменчивостью. В нашей лаборатории используется технология полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (RealTime ПЦР), позволяющая произвести количественную и качественную оценку присутствия вирусной ДНК в образце непосредственно во время реакции. выполнение комплексных тестов таких социально значимых заболеваний, как выявление возбудителей острых респираторных вирусных инфекций человека (ОРВИ) , гриппа, выявление возбудителей острых кишечных инфекций (ОКИ), флороценоз (гинекология) и т.д.

Возможности нашей ПЦР -лаборатории в диагностике инфекционных заболеваний: Гемотрансмиссивные вирусы, Респираторные инфекции, ИППП, Гнойно-септические инфекции, Энцефалиты/менингиты, Кишечные инфекции, TORCH- инфекции.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является одним из методов диагностики, позволяющих добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК/РНК) в биологическом материале (пробе) с использованием фермента ДНК-полимеразы.

Преимущества метода ПЦР:

— высокая чувствительность – выявляет единичные клетки;

— высокая специфичность – определяет уникальный фрагмент ДНК-возбудителя;

— быстрота получения результата и универсальность проведения реакции – ответы выдаются на следующий день после сдачи анализа;

— диагностика любых видов микроорганизмов – культивируемые, некультивируемые, персистирующие формы.

Для исследования используется биологический материал, в котором предполагается обнаружение патогена – соскоб из цервикального канала, уретры, влагалища; сперма, секрет простаты, моча, амниотическая жидкость, биоптат лёгких, печени, бронхоальвеолярный лаваж, кровь, мазок носоглотки, ротоглотки, мокрота, отделяемое конъюнктивы, плевральная жидкость, синовиальная жидкость, слюна, спинномозговая жидкость и др.

Актуальность и обоснованность применения ПЦР-технологии обусловлена тем, что инфекции урогенитального тракта в настоящее время характеризуются отсутствием патогномоничных специфических симптомов, стёртыми клиническими проявлениями, многоочаговостью инфицирования, что представляет значительные трудности для рутинной клинической диагностики и своевременной адекватной терапии.

Наша лаборатория проводит как качественные, так и количественные ПЦР-исследования.

Мы выполняем уникальный анализ ФЕМОФЛОР, который позволяет из одной биопробы выполнить количественную оценку общей бактериальной массы, нормофлоры (лактобациллы, типичные для урогенитального тракта женщин) и комплекса аэробных и анаэробных микроорганизмов, микоплазм, грибов рода Candida, ассоциированных с развитием специфических и неспецифических вульвовагинитов, бактериального вагиноза.

В случае необходимости проведения комплексной качественно-количественной оценки состояния урогенитального тракта женщин рекомендовано исследование ФЕМОФЛОР-СКРИН, которое объединяет тестирование на наличие основных патогенов – возбудителей инфекций, передаваемых половым путём (ИППП) и количественное исследование важнейших показателей состояния микробиоценоза.

Принимая во внимание клиническую и социальную значимость заболеваний мочеполовой системы у мужчин, часто стертого или асимптомного течения, а также важность равноценного обследования обоих половых партнёров при нарушениях репродуктивной функции и наличии заболеваний урогенитального тракта мы выполняем анализ АНДРОФЛОР, который позволяет осуществлять диагностику инфекционно-воспалительных заболеваний мочеполовой системы у мужчин.

Проблема диагностики и лечения заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломы человека (HPV) является актуальной в связи с ростом заболеваемости (ежегодно диагностируется около 500 тыс. новых случаев рака шейки матки), значительной контагиозностью и высоким онкогенным потенциалом возбудителя. В нашей лаборатории выполняется качественный тест – СКИНИНГ Human papillomavirus (HPV) высокого онкогенного риска, и количественный тест Human papillomavirus (HPV) 21 типа — вирусы высокого и низкого онкогенного риска.

Показания

— клинические и/или лабораторные признаки воспалительного процесса урогенитального тракта;

— дисбиотические нарушения на фоне различных воздействий, в том числе:

· лечение антибиотиками, гормонами, цитостатиками;

· использование контрацептивов, в том числе внутриматочной спирали;

· спринцевание;

· смена полового партнёра;

— предстоящие оперативные манипуляции на органах малого таза с высоким риском инфекционных осложнений;

— беременность (во всех триместрах);

— обследование при планировании беременности.

Методика

Для диагностики количественных анализов используется метод ПЦР в режиме реального времени (Real-Time PCR) на анализаторе ДТ-96, реагенты фирмы «ДНК-технология».

Для диагностики качественных тестов используется метод ПЦР с анализом результатов «по конечной точке» с использованием амплификатора «Терцик» и детектора «Джин-4», реагенты фирмы ДНК-технология.

Подготовка

Не рекомендуется сдавать анализ во время менструации.

Не рекомендуется осуществлять спринцевание влагалища в течение суток до сдачи мазка, использовать вагинальные антибактериальные свечи. Для исключения искажений результатов определения состава микрофлоры из-за присутствия в урогенитальном тракте транзиторной микрофлоры в течение 3 дней перед взятием биоматериала рекомендуется половое воздержание или защищённый половой контакт. Рекомендуется воздержаться от мочеиспускания в течение 3 часов до сдачи мазка. Если предполагается исследование материала со слизистой оболочки ротовой полости, перед обследованием необходимо воздержаться от принятия пищи и жидкости в течение нескольких часов.

Сбор утренней порции мочи проводится в стерильный контейнер.

Полимеразная цепная реакция

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *